События открытия происходят после Assassin's Creed II и перед Assassin's Creed: Brotherhood. Игрок берет на себя роль Эцио Аудиторе да Фиренце, действие которого происходит в основном в Испании, где Эцио борется с инквизицией, пытаясь освободить своих товарищей-убийц и сорвать злые планы, которые замышляют тамплиеры.
В игре используется полная 3D-графика, но с фиксированной камерой, поэтому она работает и ощущается как платформер с боковой прокруткой. Эцио, как всегда, смертоносен, но его арсенал ограничен клинком и метательными ножами. Каждая миссия имеет определенный режим, который в некоторой степени определяет, как следует проходить уровень. Режим скрытности позволяет вам быть замеченным врагом только определенное количество раз, прежде чем вам придется начинать заново с последней контрольной точки. Режим погони требует, чтобы вы убежали или добрались до какого-то места или кого-то за отведенное время. А обычный режим позволяет вам выбрать подход к миссии, который вы хотите использовать. Вы можете бегать и рубить врагов или красться и совершать скрытные убийства.
В отличие от консольных версий игр, прыжок веры довольно ограничен, и вы никогда не увидите сено, в которое прыгаете, и большинство из них все равно происходит в виде кат-сцены. Но есть укрытия, такие как тени, тележки с сеном, кусты или пустые бочки, которые помогут вам в ваших тайных миссиях. Если вы приближаетесь к врагу сзади, вы можете совершить скрытное убийство одним ударом, но если вы предпочитаете лобовую атаку, тип боя будет варьироваться в зависимости от вашего противника. Более сильные противники могут блокировать ваши атаки, и вам придется либо сломать их защиту, либо полагаться на контратаки, чтобы нанести им вред. Все ходы не будут доступны с самого начала и будут открываться постепенно по ходу сюжета.